La leishmaniasis es una enfermedad ulcerosa causada por un protozoo con una alta presencia en ciertos animales como los perros, y que puede afectar también a los seres humanos. Normalmente se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa para identificar secuencias concretas de ADN del parásito. La innovación de este trabajo se encuentra en la amplificación isotérmica mediante cebadores marcados con nanopartículas de oro y microesferas magnéticas, lo cual mejora la eficiencia en la detección de esta enfermedad.
En el presente trabajo se ha aplicado con éxito un nuevo método cualitativo y cuantitativo para la detección de secuencias de ADN características del parásito Leishmania infantum, un kinetoplasto frecuente en veterinaria que también afecta a humanos.
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es el método estándar para identificar la presencia de una secuencia concreta de ADN en una muestra. La PCR utiliza enzimas celulares y dos cebadores, unas secuencias cortas de ADN que servirán de punto de inicio para la síntesis del ADN copiado. Cuando la detección es positiva, esta técnica produce millones de copias de la secuencia problema facilitando su detección. Esta amplificación del ADN implica cambios de temperatura muy precisos (termociclación) así como equipo sofisticado y caro, unas limitaciones que ya han sido superadas por una estrategia alternativa llamada amplificación isotérmica, que como su nombre indica se desarrolla a temperatura constante.
En este contexto, los autores del artículo presentan un nuevo diseño de la amplificación isotérmica que utiliza cebadores marcados con nanopartículas de oro y microesferas magnéticas. La secuencia amplificada al final del proceso contendrá ambos marcadores permitiendo una rápida purificación y cuantificación. Las propiedades magnéticas del primer cebador facilitan la purificación/preconcentración del ADN amplificado gracias a métodos magnéticos de separación. Por otra parte, los cebadores marcados con nanopartículas de oro se pueden cuantificar de forma sencilla con métodos de detección electrocatalítica. Por lo tanto, el uso de los cebadores marcados convierte la amplificación isotérmica en un método de diagnóstico cualitativo y cuantitativo más rápido y fácil de aplicar.
Esta nueva estrategia se aplicó con éxito en la detección de una secuencia de ADN característica del parásito L. infantum, un kinetoplasto responsable de una enfermedad que afecta a perros domésticos, perros salvajes y también a humanos. El método resultó sensible y fácilmente reproducible. Además, el ADN amplificado de perros sin Leishmania se pudo discriminar perfectamente, demostrando la especificidad tanto del proceso de amplificación como de la detección electroquímica. De hecho, el rendimiento del nuevo método es mejor que el obtenido por otros tests para la detección de Leishmania, ofreciendo además una cuantificación del número de parásitos. Esta nueva estrategia se podría aplicar en cualquier diagnóstico basado en técnicas de amplificación isotérmica de ADN.
El diagnóstico veterinario es una herramienta clave para la prevención y control de enfermedades infecciosas en animales. Hay una necesidad urgente de innovar en este campo, facilitando que lleguen al mercado herramientas de diagnóstico más específicas, rápidas y eficientes. El proyecto Europeo del FP7 llamado Point of Care Diagnostics for rapid and cheap pathogen detection of companion animals (POC4PETS) quiere aplicar las nuevas tecnologías más prometedoras en el diagnóstico veterinario de los patógenos que afectan a los animales de compañía. La tecnología presentada en el presente artículo está en proceso de ser patentada (EP14382266.6/P10398EP00 (09/07/14); PCT/EP2015/065742 (09/07/15)).
El trabajo se ha liderado desde el Institut Català de Nanociència i Nanotecnologia (ICN2), un centro de investigación ubicado en el Campus Bellaterra de la Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), y la compañía spin off Vetgenomics (www.vetgenomics.com).
Fuente: ICN2 – Más información
Investigador de contacto: Arben Merkoçi
arben.merkoci@icn.cat
Grupo de Nanobioelectrónica y Biosensores, Institut Català de Nanociència i Nanotecnologia
Referencia
“Magnetic Bead/Gold Nanoparticle Double-Labeled Primers for Electrochemical Detection of Isothermal Amplified Leishmania DNA” SMALL. 2016, 12(2): 205-213. de la Escosura-Muñiz, Alfredo; Baptista-Pires, Luis; Serrano, Lorena; Altet, Laura; Francino, Olga; Sánchez, Armand; Merkoçi, Arben.
